项目四 发酵工业的无菌操作

项目四 发酵工业的无菌操作 61

度重视前期污染问题，发现发酵前期污染杂菌时，应迅速重新灭菌，再接种进行发酵。如果杂菌消耗了过多的营养成分，还应进行适当补充，重新灭菌和接种发酵。

(3)发酵中期染菌 发酵中期染菌将会培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成，有的染菌后杂菌大量繁殖,产生酸性物质，使pH值下降，糖、氢等的消耗加速，菌体发生自溶，致使发酵液发黏，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止，有的染菌后会使已生成的产物被利用戒破坏，从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现、快处理，根据不同的发酵类型及具体情况进行处理，如抗生素发酵污染，可以将另一罐发酵正常，发酵单位高的发酵液的一部分输入到染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，又如柠檬酸发酵中期染菌，可以根据所染杂菌的类型分别处理，如果污染酵母菌，可以加人抑制酵母菌生长但对生产菌又无影响的硫酸铜，同时提高通气量来加速发酵产酸;如果污染了细菌，可以通过加大通气量，使菌体加速发酵产酸来降低pH值,以抑制细菌的生长，必要时还可以加入盐酸调节pH值来抑制细菌生长:如污染了黄曲霉等霉菌，通过各种方式降低pH，促使杂菌自溶，以减少发酵中期霉菌污染的影响，

(4)发酵后期染菌 由于发酵后期养基中的糖等营养物质即将耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵,对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物影响不同，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大，肌苷酸，谷氨酸、氨基酸等的发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。

3.染菌程度对发酵的影响

染菌程度对发酵的影响很大。染菌程度愈严重，即进入发酵罐内的杂菌数量愈多，对发酵的危害也就愈大。当生产菌在发酵过程中已有大量的繁殖，并已在发酵液中占优势，污染极少量的杂菌，对发酵不会带来太大的影响，因为进入发酵液的杂菌需要一定的时间才能达到危害发酵的程度，而且此时环境对杂菌繁殖已相当不利。当然如果染菌程度严重时，尤其是在发酵的前期或发酵的中期，对发酵将会产生严重的影响。

4.染菌对产物提取和产品质量的影响

对于丝状菌发酵被污染后，有大量菌丝自溶，发酵液发，有的甚至发臭，发酵液过滤困难，发酵前期染菌过滤更困难，严重影响产物的提取收率和产品质量。在这种情况下可先将发酵液加热处理，再加助滤剂或者先加絮凝剂，使蛋白质凝聚，有利于过滤，

(二) 杂菌污染的防治

在发酵生产过程中，构成发酵染菌的原因错综复杂，涉及的范围比较广，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因此，杂菌的污染必须能够迅速、准确地被检测出来。

1.污染杂菌的检测

目前常用的无菌检测方法主要有以下四种，

(1)显微镜检查法(镜检法)通常用兰染法，先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。根据生产菌与杂菌的特征来判断染菌与否，必要时，还可进行芽孢染色和鞭毛染色。镜检法简单、直接，是最常用的方法之一，但对于发酵周期短的生产菌，要辨别其发酵早期是否污染十分困难，因为杂菌要繁殖到一定数量后才能被镜检出来，因而该方法具有一定局限性。

(2)肉汤培养法 将需检查样品接入经灭菌并经过检查的无菌肉汤培养基中，于37℃

60 发置酵置技置术

※基础知识

一、发酵工业污染的防治策略

(一)污染的危害①杂菌大量游耗培养基中的营养物质,使生产菌的生产能力下降。如果发酵过程中污染了杂菌，对菌体的生长和代谢会产生严重影响，会导致以下危害。

数增加了下游产物分离纯化的难度，造成产物收率降低或产品质量下降， 杂菌产生的代谢产物、增加了发酵液中杂质类型或改变了发酵液理化性质，从面导

③杂菌代谢会改变培养体系的pH，使发酵过程异常，杂菌的代谢可能会降解产物、使产物得率降低。

⑤若细菌的培养过程被噬菌体污染，细菌细胞会被裂解，造成发酵失败。

污染对发酵过程、产品质量及产量会产生很大影响，因此，发酵过程应该是一个纯种培养过程。在许多生物产品的发酵生产中，经常会发生污染。如国外抗生素发酵染菌车为2%~5%，国内青霉素发酵染菌率为2%;链霉素、四环素和红霉素发酵污染率为5%,省氨酸发酵噬菌体污染率为1%~2%。发酵生产的产品不同，污染杂菌的种类不同，污染时

期及途径不同，所产生的后果是不同的。

1.染菌对不同发酵过程的影响

由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同。染造成的危害程度也不同。如青霉素的发酵过程，由于许多杂菌都能产生青霉素酶,因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低危害十分严重;对于核苷或核苷酸的发酵过程，由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物,其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成;对于柠檬酸等有酸的发酵过程,一般在产酸后，发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中,期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌;谷氨酸发酵中，谷氨酸棒杆菌生长迅速发酵周期短，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的威胁非大，无论是哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。

2.染菌发生的不同时期对发酵的影响

从发生染菌的时期来看，染菌可分为种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染发酵后期染菌等四个不同的染菌时期，不同的染菌时期对发酵所产生的影响也是有区别的(1)种子培养期染菌种子培养的目的在于促进微生物细胞生长与繁殖，此时，微生!菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后

并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。

(2)发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。因此，在发醒